关于色谱柱HILIC分离模式？收藏这一篇就够了！
HILIC—亲水作用色谱，是一种互补于RP的色谱技术，它不仅可以成功提高对极性非常强物质的保留，还能够为包含极性物质和可离子化合物的混合物提供正交于RP的独立分离模式。它是通过采用高乙腈低水含量的流动相与极性固定相的组合，按亲水性（极性）由小到大的顺序梯度洗脱分析物得以实现的。因所使用的固定相为极性（裸硅胶、酰胺、氨基等），故可轻易吸附水和其他极性溶剂。并且，HILIC不需要添加离子对试剂，可以方便地与质谱联用，特别适合于电喷雾离子源模式（ESI）。
下面介绍下HILIC方法的开发指南：
01
使用梯度条件，确定化合物对HILIC的适用性
1A：90%乙腈等度运行2.5min—这段时间是用来确定一个化合物在HILIC模式下是否弱保留
1B：梯度洗脱设置时间为7.5min—这段时间是理想的洗脱区域，开始和结束时的有机相百分比均可以调整，以得到最优的选择性。
1C：最后用50%乙腈等度运行2.5min—这段时间是用来确定一个化合物在HILIC模式下是否强保留。
02
使用两个不同的pH值筛选适合化合物的方法
流动相的pH在HILIC模式中对保留和选择性的影响要比在反相分离中大很多。
筛选A
7.5min内90%-50%乙腈/缓冲液
缓冲盐：5mM甲酸铵pH3.2，5mM有效浓度*
通道A：90/10乙腈/50mM甲酸铵pH3.2
通道B：50/40/10乙腈/水/50mM甲酸铵pH3.2
筛选B
7.5min内90%-50%乙腈/缓冲液
缓冲盐：5mM醋酸铵pH5.8，5mM有效浓度*
通道A：90/10乙腈/50mM醋酸铵pH5.8
通道B：50/40/10乙腈/水/50mM醋酸铵pH5.8
维持有效的缓冲液浓度
缓冲液的有效浓度是混合流动相中的缓冲液浓度。在上面的筛选A例子中，5mM甲酸铵的90v/v%乙腈溶液是通过加100mL 50mM甲酸铵pH3.2缓冲液至900mL乙腈中并混匀制得的。没有必要因体积收缩而调整。每种流动相中都有5mM的缓冲液是确保在整个梯度过程中流动相离子强度保持恒定，从而有更加耐用的方法。恒定的缓冲液浓度可以通过使用四元泵实现，只需设置缓冲通道至一个恒定的值，如10% 50mM缓冲液，而不需预先混合流动相。
03
使用铵作为缓冲液的阳离子
缺乏恰当的阳离子可能会导致不重现的HILIC的结果。我们建议使用铵作为有效的反离子，如下所示。
甲酸铵—在HILIC分离中使用5mM甲酸铵在重复进样后也有稳定的保留。
甲酸—在HILIC分离中使用0.1%甲酸(pH2.7)在重复进样后可能会失去保留。
HILIC只是一种色谱分离模式，并不是色谱柱的简称。
目前商品化的HILIC材料的种类日益丰富，涵盖了裸硅胶、氨基、二醇基、酰胺、糖型、两性离子型等各种键合相，不同的HILIC相之间的选择性是不同的，不同的HILIC柱应视为互补的选择性。可提供的HILIC模式色谱柱有以下几种：
Luna NH2
氨基固定相，出厂为正相体系：正己烷/乙腈（99:1），pH：1.5-11。如果用于HILIC模式分离，需先用异丙醇或者纯乙醇小流速长时间的置换，再用流动相条件平衡。
Luna氨基色谱柱寿命长，键合相流失低，重现性好，为反相条件下的简单糖、复杂多糖和糖醇以及正相条件下的氢键化合物提供出色的保留能力。
Luna HILIC
二醇基固定相，出厂条件为：乙腈/100mM甲酸铵（pH3.2）（体积比为90:10），pH：1.5-8.0。
Luna HILIC色谱柱在硅胶表面会保持一个富水层，富水层可以促进极性化合物向固定相的转移，从而增加保留。还可提高质谱灵敏度，提高实验室通量和产率。
Kinetex HILIC
裸硅胶为固定相，出厂条件为：乙腈/100mM甲酸铵 (93:7)，pH：2.0-7.5。
1.7μm、2.6μm、5μm可供选择，区别与全多孔硅胶，Kinetex HILIC是核壳技术，即使用纳米级的溶胶凝胶处理技术，在实心硅胶上生成均一稳定的多孔外壳。会实现更快的分析、更少的溶剂消耗，同等条件下提高分离度而不增加背压。
Venusil Honey NH2—食品中糖类检测专用柱
氨基固定相，出厂条件为：纯甲醇，pH：2.0-8.0。
全新艾杰尔Venusil Honey食品中糖类检测专用柱，专为参考国标方法进行食品中糖类检测而设计，可以有效提高五种糖、尤其是最难分离的麦芽糖和乳糖之间的分离度，是一款性价比超高的食品中糖类检测的色谱柱。
Luna Omega SUGAR
新型含氮固定相在HILIC条件下
大大增加了糖和糖醇的保留
酰胺多元醇固定相，出厂条件为：乙腈/水 (体积比为80:20或85:15)，pH:2.0-7.0。
Luna Omega SUGAR集热改性全多孔颗粒的性能优势和新型HILIC固定相于一身，包含酰胺/氨基固定相和极性封尾的多官能选择性提升碳水化合物的保留和分离。极大地改善了传统固定相的保留和分离能力，同时还可以获得更高的峰响应，也不需要使用缓冲液或离子对试剂。
BioZen Glycan
为释放的多糖提供高效和高选择
性的理想组合
酰胺多元醇固定相，出厂条件为：乙腈/100mM甲酸铵(pH3.2) (体积比为90:10)，pH：2.0-7.5。
BioZen Glycan的独特选择性旨在提供对释放和标记多糖的高阶分离。借助2.6μm的核壳颗粒，客户可在HPLC或UHPLC系统上以更高的线速度获得更尖锐的峰型，且不额外带来高背压。同时，此柱装填在独特的生物惰性钛管中，减少了样品损失和吸附量。
HILIC色谱柱也有几点注意事项注意：
流动相中有机相含量：HILIC模式中常用的洗脱溶剂强度由弱到强为：丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水。在这里，水是强洗脱溶剂。另外，流动相中需要至少保持5%的极性溶剂（5%水相/5%甲醇或者3%甲醇/2%水相），这可以保证填料始终被水浸润。
最常用的缓冲盐是乙酸铵和甲酸铵，浓度范围通常为5-100mM。磷酸盐缓冲液需要注意避免析出的风险。
如果可能，尽量用100%乙腈或者初始流动相溶解样品，避免使用纯水溶解，会有溶剂效应导致峰型差。
初步探索色谱条件时，可运行95%乙腈至50%乙腈的梯度。（甲醇极性大，一般不使用），常用的条件为75:25的乙腈水或者80:20的乙腈水体系。如果使用梯度洗脱，请注意确保每次进样之前色谱柱得到充分的平衡，如果不这样做会导致保留时间漂移和重现性较差。
可使用甲醇、乙醇、异丙醇之类的极性溶剂代替水，来增强保留。
色谱柱的清洗及保存：
清洗：体系不含盐时，可以梯度洗脱从95/5（乙腈/水）至50/50（乙腈/水），以除去极性污染物；若体系含有盐溶液，需先用等比例不含盐溶液冲洗一段时间，再逐步提高水相比例，来进行清洗。
保存：短期存放可放在乙腈/水（95/5）中，若长期不使用，需保存在纯乙腈内，并将色谱柱两端堵头拧紧封好，以防柱床干涸。
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